تثبیت هم زمان آنزیم های آلفا آمیلاز، گلوکوآمیلاز و پلولاناز با استفاده از روش توده های تجمع یافته با اتصال جانبی برای تولید شربت گلوکز از نشاسته

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسنده

عضو هیات علمی، گروه صنایع غذایی، پژوهشکده فنآوری های شیمیایی

چکیده

در این تحقیق، تجمعات آنزیمی متقاطع آلفا-آمیلاز مقاوم به حرارت (از باسیلوس لیکنیفورمیس)، گلوکوآمیلاز (از آسپرژیلوس نیجر) و پولولاناز (از باسیلوس سوبتیلیس) که توسط یون‌های کلسیم و سدیم و BSA به عنوان تغذیه‌کننده پروتئینی غنی شده بودند، تهیه گردید. در ابتدا، استون، استونیتریل، ایزوپروپانول، سولفات آمونیوم اشباع، اتانول و ترت-بوتانول برای تشکیل توده های تجمع آنزیم استفاده شدند. در بین آنها، ترت-بوتانول بالاترین فعالیت آنزیمی را در مقایسه با سایر رسوب‌ دهنده‌ها نشان داد. شرایط بهینه فرآیند تثبیت برای این سه آنزیم و تشکیل CLEAs عبارت بودند از: غلظت گلوتارآلدئید: 5 میلی‌مولار، نسبت مخلوط آنزیم آلفا-آمیلاز: گلوکوآمیلاز: پولولاناز) 3: 1: 1، نسبت آنزیم به سرم آلبومین گاوی 2:1 و زمان اتصال عرضی 5/2 ساعت، در دمای 2-3 درجه سانتیگراد. دما و pH بهینه برای آلفا-آمیلاز آزاد 95 درجه سانتیگراد و pH 5.5 برای گلوکوآمیلاز و پولولاناز به ترتیب 60-62 درجه سانتیگراد و pH 5.5 تعیین گردید. CLEAs تشکیل شده توسط ترت-بوتانول و نسبت آنزیم به BSA برابر با 1:2 دارای دمای بهینه 60-62 درجه سانتیگراد و pH بهینه 5.5 بود. ارزیابی پارامترهای سینتیکی CLEAs ترکیبی در مقایسه با مجموعه آنزیم‌های آزاد نشان داد که Km کاهش، Vmax و راندمان کاتالیزوری افزایش یافته است. علاوه بر این، CLEAs ترکیبی حاصل شده، پس از 10 چرخه، فعالیت آنزیمی خود را تا حدود 74٪ حفظ کرده است. همچنین، ارزیابی پایداری حرارتی و نیمه عمر آنزیم‌های تثبیت‌شده حدود 3 برابر بیشتر از آنزیم‌های آزاد بود. این افزایش فعالیت به دلیل افزودن نسبت 3:1 یون‌های Ca2+/Na+ به مخلوط آنزیم در طول تشکیل CLEAs می باشد. افزودن یون‌ها، پایداری حرارتی، پایداری عملکردی و نیمه عمر آنزیم را بهبود بخشیده است. بر این اساس، CLEAs ترکیبی حاصل از سه نوع آنزیم آمیلاز به عنوان یک بیوکاتالیست با سهولت کارکرد، افزایش اثربخشی کاتالیستی، سازگار با محیط زیست و مقرون به صرفه برای طراحی فرآیندی یکپارچه جدید در تولید شربت گلوکز از نشاسته معرفی می‌گردد.

چکیده تصویری

تثبیت هم زمان آنزیم های آلفا آمیلاز، گلوکوآمیلاز و پلولاناز با استفاده از روش توده های تجمع یافته با اتصال جانبی برای تولید شربت گلوکز از نشاسته

تازه های تحقیق

  • توده های متصل شده با اتصالات جانبی از مجموعه آمیلازهای ترکیبی ساخته شده است.
  • بیوکاتالیست طراحی شده برای استخراج همزمان شربت گلوکز از نشاسته تهیه گردید
  • بیوکاتالیست مقاوم به حرارت با نیمه عمر بالا تر نسبت به مجموعه آنزیم های آزاد ساخته شد
  • بیوکاتالیست تهیه شده دارای کارایی کاتالیتیکی بالا می باشد

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Co-immobilization of alpha-amylase, glucoamylase, and pullulanase by cross-linked enzyme aggregates approach for glucose syrup production from starch

نویسنده [English]

  • Homa Torabizadeh
Department of Chemical Technologies, Food Science and Technology Group, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran
چکیده [English]

In this research, cross-linked enzyme aggregates of thermostable α-amylase (from Bacillus licheniformis), glucoamylase (from Aspergillus niger), and pullulanase (from Bacillus subtilis) that was enriched by calcium and sodium ions and BSA as a proteic feeder were prepared. Initially, acetone, acetonitril, isopropanol, saturated ammonium sulfate, ethanol, and tert-butanol were used for enzyme aggregation. Among them, tert-butanol has the highest enzyme activity compared to compared to other precipitators. The optimum conditions of the immobilization process for these three enzymes and CLEAs formation were: glutaraldehyde concentration: 5mM, enzyme mixture ratios (α-amylase: glucoamylase: pullulanase) was 3: 1: 1, Enzyme/ BSA ratio 1:2, and crosslinking time 2.5 h, at 2-3° C. The optimum temperature and pH for free α-amylase were 95° C, and pH, 5.5, for glucoamylase and pullulanse were 60-62° C, pH 5.5 respectively. CLEAs that was formed by tert-butanol and 1: 2 enzyme/ BSA ratio has the optimum temperature 60-62° C, and optimum pH of 5.5. Kinetic parameters assessment of combi-CLEAs compared to free mixed enzymes revealed that, Km is decreased, Vmax enhanced and catalytic efficiency is increased. Moreover, resulted multi-CLEAs has a reusability about 74% after 10 cycles. Besides, the thermal stability and enzyme half-life of the immobilized enzymes was enhanced about 3 folds than free ones. This raising of activity was owing to the addition of 3: 1 ratio of Ca2+ / Na+ ions to the enzyme mixture during CLEAs formation. This ions addition improves thermostability, functional stability and enzyme half-lives. Accordingly, combi-CLEAs of three amylases introduces as a biocatalyst with ease of operation, enhanced efficacy, eco-friendly and cost effective for a new integrated process design in glucose syrup production from starch.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Multi-Enzyme immobilization
  • CLEAs
  • Thermostable α-amylase
  • Glucoamylase
  • Pullulanase
[1] Talekar, S., Desai, S., Pillai, M., & Nadar, S.S. (2013). Carrier free co-immobilization of glucoamylase and pullulanase as combi-cross linked enzyme aggregates (combi-CLEAs). RSC Adv., 3(7), 2265-2271.
[2] Punia Bangar, S., Sunooj, K. V., Navaf, M., Phimolsiripol, Y., & Whiteside, W. S. (2024). Recent advancements in cross-linked starches for food applications- a review. Int. J. Food Prop., 27(1), 411-430.
[3]   Sheldon, R. A. (2019). CLEAs, Combi-CLEAs and ‘smart’ magnetic CLEAs: Biocatalysis in a bio-based economy, Catalyst. 9, 261. https://doi.org/10.3390/catal9030261.
[4]    Rehman, S., Nawaz Bhatti, H., Bilal, M., & Asgher, M. (2016). Cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) of Pencilluim notatum lipase enzyme with improved activity, stability, and reusability characteristics, Int. J. Biol. Macromol., 91, 1161-1169. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2016.06.081.
[5]   Xu, M. Q., Wang, S. S., Li, L. N., Gao, J., & Zhang, Y. W. (2018). Combined coross-linked enzyme aggregates as biocatalysts, Catalyst, 8, 460. https://doi.org/10.3390/catal8100460.
[6] Min, Y., Yi, J., Dai, R., Liu, W., & Chen, H. (2023). A Novel Efficient Wet Process for Preparing Cross-Linked Starch: Impact of Urea on Cross-Linking Performance. Carbohydr. Polym., 320, 121247. DOI: 10.1016/j.carbpol.2023.121247.
[7] Torabizadeh, H., & Montazeri, E. (2020). Nano co-immobilization of α-amylase and Maltogenic amylase by nanomagnetic combi-cross-linked enzyme aggregates method for maltose production from corn starch. Carbohydr. Res., 488, 107904. https://doi.org/10.1016/j.carres.2019.107904.
[8] Torabizadeh, H., & Mahmoudi, A. (2018). Inulin hydrolysis by inulinase immobilized covalently on magnetic nanoparticles prepared with wheat gluten hydrolysates, Biotechnol. Reports., 17, 97–103. https://doi.org/10.1016/j.btre.2018.02.004.
[9]        Mahmoudi, A., & Torabizadeh, H. (2018). Nanomagnetic wheat gluten hydrolysates a new carrier for nanoimmobilization of inulinase, Int. J. Biol. Macromol., 117, 108–113. https://doi.org/10.3390/catal8050174.
[10]      Torabizadeh, H., & Mikani, M. (2018). Nano-magnetic cross-linked enzyme aggregates of naringinase an efficient nanobiocatalyst for naringin hydrolysis, Int. J. Biol. Macromol., 117, 134–143. https://doi.org/10.1016/J.IJBIOMAC.2018.05.162.
[11]      Torabizadeh, H., & Mikani, M. (2018). Kinetic and thermodynamic features of nanomagnetic cross-linked enzyme aggregates of naringinase nanobiocatalyst in naringin hydrolysis, Int. J. Biol. Macromol., 119, 717–725. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.08.005.
[12]      Torabizadeh, H., Tavakoli, M., & Safari, M. (2014). Immobilization of thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis by cross-linked enzyme aggregates method using calcium and sodium ions as additives, J. Mol. Catal. B Enzym. 108, 13–20. https://doi.org/10.1016/J.MOLCATB.2014.06.005.
[13]      Xie, W., & Wang, J. (2014). Enzymatic Production of Biodiesel from Soybean Oil by Using Immobilized Lipase on Fe3O4/Poly(styrene-methacrylic acid) Magnetic Microsphere as a Biocatalyst, EnFL., 28, 2624–2631. https://doi.org/10.1021/EF500131S.
[14]   Blanco-Llamero, C., Garcia-Garcia, P., & Senorans, F. J. (2021). Cross-linked enzyme aggregates and their application in enzymatic pretreatment of microalgae: comparison between CLEAs and combi-CLEAs, Front. Bioeng. Biotechnol., 9, 1-11. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021794672.
[15]      Cruz-Izquierdo, A., Picó, E. A., López, C., Serra, J. L., & Llama, M. J. (2014). Magnetic Cross-Linked Enzyme Aggregates (mCLEAs) of Candida antarctica lipase: An efficient and stable biocatalyst for biodiesel synthesis, PLoS One., 9, 1–22. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0115202.
[16] Sheldon, R. A., Von Pelt, S., Kanbak-Aksu, S., & Janssen, S.M.H.A. (2013). Cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) in organic sythesis, Aldrichim. ACTA., 46(3), 81-93.
[17] Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent fordetermination of reducing sugar. Anal. Chem., 31, 426e8.
19] Baltulionis, G., Blight, M., Robin, A., Charalampopoulos, D., & Watson, K. A. (2021). propeptide-mediated autoinhibition and intermolecular chaperone in the maturation of cognate catalytic domain in leucine aminopeptidase, J. Struct. Biol., 213, 107741-107741. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2021.107741.
[20] Tutar, H., Yilmaz, E., Pehlivan, E., & Yilmaz, M. (2009). Immobilization of Candida rugosa lipase on sporopollenin from Lycopodium clavatum, Int. J. Biol. Macromol., 45, 315–320. https://doi.org/10.1016/J.IJBIOMAC.2009.06.014.
[21] Bié, J., Sepodes, B., Fernandes, P.C.B ., & Ribeiro, M.H.L. (2022). Enzyme Immobilization and Co-Immobilization: Main Framework, Advances and Some Applications, Processes., 10(3), 494; https://doi.org/10.3390/pr10030494.
[22] Perwez, M., Mazumder, J.A., Noori, R., & Sardar, M. (2021). Magnetic combi CLEA for inhibition of bacterial biofilm: A green approach, Int. J. Biol. Macromol., 186, 780–787. https://doi.org/10.1016/J.IJBIOMAC.2021.07.091.
[23] Yu, D., Ma, X., Huang, Y., Jiang, L., Wang, L., Han, C., & Yang, F. (2022). Immobilization of cellulase on magnetic nanoparticles for rice bran oil extraction in a magnetic fluidized bed, Int. J. Food Eng., 18, 15–26. https://doi.org/10.1515/ijfe-2021-0111.
[24] Mikani, M., Torabizadeh, H., & Rahmanian, R. (2018). Magnetic soy protein isolate–bovine serum albumin nanoparticles preparation as a carrier for inulinase immobilization, IET Nanobiotechnol., 12, 633–639. https://doi.org/10.1049/IET-NBT.2017.0188.
[25] Royhaila Mohamad, N., Haziqah, N., Marzuki, C., Buang, A., Huyop, F., & Wahab, R. A. (2015). An overview of technologies for immobilization of enzymes and surface analysis techniques for immobilized enzymes, Agric. Environ. Biotechnol, 29(2), 205-220. https://doi.org/10.1080/13102818.2015.1008192.
[26] Cruz-Izquierdo, A., Picó, E. A., Anton-Helas, Z., Boeriu, C. G., Llama, M. J., & Serra, J. L. (2012). Lipase immobilization to magnetic nanoparticles: methods, properties and applications for biobased products, N. Biotechnol., 29, S100–S101. https://doi.org/10.1016/J.NBT.2012.08.283.
[27] Sailaja AK, C. P., & Amareshwar P. (2011). Different techniques used for the preparation of nanoparticles using natural polymers and their application., Int J Pharm Pharm Sci., 3, 45–50.
[28] Torabizadeh, H., Habibi-Rezaei, M., Safari, M., Moosavi-Movahedi, A. A., &Razavi, S. H. (2010). Semi-rational chemical modification of endoinulinase by pyridoxal 5′-phosphate and ascorbic acid, J. Mol. Catal. B Enzym., 62, 257–264. https://doi.org/10.1016/J.MOLCATB.2009.10.007.
[29] Torabizadeh, H., Habibi-Rezaei, M., Safari, M., Moosavi-Movahedi, A. A., Sharifizadeh, A., Azizian, H., & Amanlou, M. (2011). Endo-inulinase Stabilization by Pyridoxal Phosphate Modification: A Kinetics, Thermodynamics, and Simulation Approach, Appl. Biochem. Biotechnol., 165, 1661–1673. https://doi.org/10.1007/S12010-011-9385-X.
[30] Barbosa, O., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, A., Torres, R., Rodrigues, R. C., & Fernandez-Lafuente, R. (2015). Strategies for the one-step immobilization–purification of enzymes as industrial biocatalysts, Biotechnol. Adv., 33, 435–456. https://doi.org/10.1016/J.BIOTECHADV.2015.03.006.
[31] Mohamad, N.R., Marzuki, N.H.C., Buang, N.A.,Huyop, F., & Wahab, R. A. (2015). An overview of technologies for immobilization of enzymes and surface analysis techniques for immobilized enzymes, Biotechnol. Biotechnol. Equip., 29, 205–220. https://doi.org/10.1080/13102818.2015.1008192.
[32] Kochane, T., Zabarauske, I., Klimkeviciene, L., Straksys, A., Maciulyte, S., Navickaite, L., Gailiunaite, S., & Budriene, S. (2020). Starch hydrolysis using maltogenase immobilized via different techniques, Int. J. Biol. Macromol., 144, 544-552. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.12.131.
[33] Gupta, K., Kumar Jana, A., Kumar, S., & Maiti Jana, M. (2015). Solid state fermentation with recovery of amyloglucosidase from extract by direct immobilization in cross linked enzyme aggregates for starch hydrolysis, Biocatal. Agric. Biotechnol., 4, 486-492. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2015.07.007.
دوره 12، شماره 3
اردیبهشت 1404
صفحه 287-303
  • تاریخ دریافت: 31 اردیبهشت 1404
  • تاریخ بازنگری: 28 تیر 1404
  • تاریخ پذیرش: 28 تیر 1404
  • تاریخ اولین انتشار: 28 تیر 1404
  • تاریخ انتشار: 01 اردیبهشت 1404