ﺳﺎزﻣﺎن ﭘﮋوهشهای ﻋﻠﻤﯽ و ﺻﻨﻌﺘﯽ اﯾﺮان فناوری‌های جدید در صنعت غذا 2783-350X 12 3 2025 04 21 Co-immobilization of alpha-amylase, glucoamylase, and pullulanase by cross-linked enzyme aggregates approach for glucose syrup production from starch تثبیت هم زمان آنزیم های آلفا آمیلاز، گلوکوآمیلاز و پلولاناز با استفاده از روش توده های تجمع یافته با اتصال جانبی برای تولید شربت گلوکز از نشاسته 287 303 1561 10.22104/ift.2025.7624.2216 FA هما ترابی زاده عضو هیات علمی، گروه صنایع غذایی، پژوهشکده فنآوری های شیمیایی 0000-0002-1063-5021 Journal Article 2025 05 21 In this research, cross-linked enzyme aggregates of thermostable α-amylase (from Bacillus licheniformis), glucoamylase (from Aspergillus niger), and pullulanase (from Bacillus subtilis) that was enriched by calcium and sodium ions and BSA as a proteic feeder were prepared. Initially, acetone, acetonitril, isopropanol, saturated ammonium sulfate, ethanol, and tert-butanol were used for enzyme aggregation. Among them, tert-butanol has the highest enzyme activity compared to compared to other precipitators. The optimum conditions of the immobilization process for these three enzymes and CLEAs formation were: glutaraldehyde concentration: 5mM, enzyme mixture ratios (α-amylase: glucoamylase: pullulanase) was 3: 1: 1, Enzyme/ BSA ratio 1:2, and crosslinking time 2.5 h, at 2-3° C. The optimum temperature and pH for free α-amylase were 95° C, and pH, 5.5, for glucoamylase and pullulanse were 60-62° C, pH 5.5 respectively. CLEAs that was formed by tert-butanol and 1: 2 enzyme/ BSA ratio has the optimum temperature 60-62° C, and optimum pH of 5.5. Kinetic parameters assessment of combi-CLEAs compared to free mixed enzymes revealed that, Km is decreased, Vmax enhanced and catalytic efficiency is increased. Moreover, resulted multi-CLEAs has a reusability about 74% after 10 cycles. Besides, the thermal stability and enzyme half-life of the immobilized enzymes was enhanced about 3 folds than free ones. This raising of activity was owing to the addition of 3: 1 ratio of Ca2+ / Na+ ions to the enzyme mixture during CLEAs formation. This ions addition improves thermostability, functional stability and enzyme half-lives. Accordingly, combi-CLEAs of three amylases introduces as a biocatalyst with ease of operation, enhanced efficacy, eco-friendly and cost effective for a new integrated process design in glucose syrup production from starch. در این تحقیق، تجمعات آنزیمی متقاطع آلفا-آمیلاز مقاوم به حرارت (از باسیلوس لیکنیفورمیس)، گلوکوآمیلاز (از آسپرژیلوس نیجر) و پولولاناز (از باسیلوس سوبتیلیس) که توسط یون‌های کلسیم و سدیم و BSA به عنوان تغذیه‌کننده پروتئینی غنی شده بودند، تهیه گردید. در ابتدا، استون، استونیتریل، ایزوپروپانول، سولفات آمونیوم اشباع، اتانول و ترت-بوتانول برای تشکیل توده های تجمع آنزیم استفاده شدند. در بین آنها، ترت-بوتانول بالاترین فعالیت آنزیمی را در مقایسه با سایر رسوب‌ دهنده‌ها نشان داد. شرایط بهینه فرآیند تثبیت برای این سه آنزیم و تشکیل CLEAs عبارت بودند از: غلظت گلوتارآلدئید: 5 میلی‌مولار، نسبت مخلوط آنزیم آلفا-آمیلاز: گلوکوآمیلاز: پولولاناز) 3: 1: 1، نسبت آنزیم به سرم آلبومین گاوی 2:1 و زمان اتصال عرضی 5/2 ساعت، در دمای 2-3 درجه سانتیگراد. دما و pH بهینه برای آلفا-آمیلاز آزاد 95 درجه سانتیگراد و pH 5.5 برای گلوکوآمیلاز و پولولاناز به ترتیب 60-62 درجه سانتیگراد و pH 5.5 تعیین گردید. CLEAs تشکیل شده توسط ترت-بوتانول و نسبت آنزیم به BSA برابر با 1:2 دارای دمای بهینه 60-62 درجه سانتیگراد و pH بهینه 5.5 بود. ارزیابی پارامترهای سینتیکی CLEAs ترکیبی در مقایسه با مجموعه آنزیم‌های آزاد نشان داد که Km کاهش، Vmax و راندمان کاتالیزوری افزایش یافته است. علاوه بر این، CLEAs ترکیبی حاصل شده، پس از 10 چرخه، فعالیت آنزیمی خود را تا حدود 74٪ حفظ کرده است. همچنین، ارزیابی پایداری حرارتی و نیمه عمر آنزیم‌های تثبیت‌شده حدود 3 برابر بیشتر از آنزیم‌های آزاد بود. این افزایش فعالیت به دلیل افزودن نسبت 3:1 یون‌های Ca2+/Na+ به مخلوط آنزیم در طول تشکیل CLEAs می باشد. افزودن یون‌ها، پایداری حرارتی، پایداری عملکردی و نیمه عمر آنزیم را بهبود بخشیده است. بر این اساس، CLEAs ترکیبی حاصل از سه نوع آنزیم آمیلاز به عنوان یک بیوکاتالیست با سهولت کارکرد، افزایش اثربخشی کاتالیستی، سازگار با محیط زیست و مقرون به صرفه برای طراحی فرآیندی یکپارچه جدید در تولید شربت گلوکز از نشاسته معرفی می‌گردد. https://jift.irost.ir/article_1561_b132ecc1609bfcf302615847c1caa69a.pdf